Cell Counting Kit-8

细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)说明书

Cell Counting Kit-8（CCK-8 kit），是一种基于WST-8原理，广泛用于检测细胞增殖和细胞毒性的试剂盒，具有高灵敏度、无放射性的特点。

    WST-8在电子耦合试剂存在的情况下，被线粒体内脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜染料（formazan）。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

图1 WST-8形成formazan原理图

CCK-8溶液可以直接加入到细胞中检测不需要预配各种成分。而且WST-8 对细胞无明显毒性。加入 CCK-8 溶液显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，检测时间更加灵活，便于确定测定时间。

标准曲线的制作

Ø   制备细胞悬液，用细胞计数板对细胞数量进行计数，接种细胞；

Ø  按比例（例如：1/2 比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5 个细胞浓度梯度，每组3-6 个重复孔。每孔约100μl 细胞悬液。

Ø  细胞接种后贴壁大约需要培养2-4 h，之后加入10μl CCK-8 试剂：加完试剂后轻轻敲击培养板以助匀。

Ø 培养箱内孵育一定时间后测定450nm 吸光度，制作出一条以细胞数量为横坐标(X 轴)，吸光度为纵坐标(Y 轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8 后的培养时间。）

细胞活性检测

Ø  在 96 孔板中接种细胞悬液，培养板于培养箱中预培养24 h；

Ø   每孔加入 10 μL 的 CCK-8 试剂 (注意不要产生气泡) ；

Ø  将培养板置于培养箱内孵育 1-4 h；

Ø 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

细胞增殖-毒性检测

Ø  在 96 孔板中接种细胞悬液，培养板于培养箱中预培养24 h；

Ø  向培养板加入不同浓度的待测药物；

Ø   将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；

Ø  每孔加入 10 μL 的 CCK-8 试剂 (注意不要产生气泡)；

Ø  将培养板置于培养箱内孵育 1-4 h；

Ø  }用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

存储条件：

4℃避光可以保存18个月。常温保存2-3周。如需长期保存，建议-20℃避光。

所需要的配套设备：

CO₂培养箱、10ul移液器、100~200ul移液器、96孔细胞培养板、450nm酶标仪

注意事项：

Ø   接种细胞时要注意细胞混合均匀，避免细胞沉淀造成每孔细胞数量不均，

Ø   96 孔板周围一圈容易蒸发，可以在周围一圈加相同量的PBS或培养基；另一方面，可以把 96 孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

Ø  对于不同的细胞CCK-8染色时间不同，检测白细胞时，由于白细胞不容易被显色，需要增加培养时间或者加大细胞接种数量，对于贴壁细胞，加入CCK-8试剂培养时间一般为 1-4 小时，但在培养 30 分钟左右可取出肉眼观察显色程度，对于悬浮细胞而言，加入CCK-8培养1-4小时后取出肉眼观察显色程度，（由于细胞种类较多，具体需要摸索条件）。

Ø   建议采用多通道移液器，以减小平行孔间的差异。

Ø   斜贴着培养板壁加入CCK-8试剂。确保孔内没有气泡，否则会干扰测定。

Ø  CCK-8检测依赖于脱氢酶催化的反应，还原剂会干扰检测，如果待检测体系中存在还原剂时，需考虑到背景OD值。

Ø   培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过

Ø   扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

Ø   CCK-8 试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深，OD 值不断增加 (注: 活细胞内的脱氢酶是持续产生的) 。

Ø   要测定细胞的具体数量，建议同时做标准曲线。

Ø  以下方法可以终止 CCK-8 反应 (96 孔板) ：(a). 在显色反应后，将培养板放置 4°C 冰箱内。(b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl溶液。(c). 每孔加 10 μL 1% (w/v) 的 SDS (十二烷基硫酸钠) 溶液。注意：反应停止后，应在 24 小时内测定。

特别声明：本产品仅限于科研使用，不可用于其他用途！